So wählen Sie das richtige Chromatographie-Harz aus

Die Chromatographie ist eine in der Chemie weit verbreitete Technik zur Trennung eines Gemischs, indem es in Lösung, als Suspension oder als Dampf durch ein Medium geleitet wird, das mit den Komponenten des Gemischs in Wechselwirkung tritt und sie mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten bewegt. Diese Bewegung basiert auf den Eigenschaften der einzelnen Moleküle, wodurch es möglich ist, eine einzelne Verbindung aus einer komplexen Probe zu trennen oder aufzureinigen.

Bei der Flüssigkeitschromatographie wird ein Harzmedium verwendet, um Antikörperfragmente, Impfstoffe und andere Biomoleküle mithilfe einer stationären Phase einzufangen und zu polieren. Dieses Verfahren trennt eine Probe in ihre einzelnen Bestandteile auf und ermöglicht so die Isolierung und Aufreinigung von Molekülen. Dazu werden zwei Substanzen benötigt – eine stationäre Phase und eine mobile Phase.

In der Bioprozesstechnik wird eine Probe auf eine stationäre Phase aufgetragen und dann durch die mobile Phase bewegt. Beide Phasen benötigen ihre eigenen Medien.

Das Chromatographie-Harz ist der Eckpfeiler dieser Prozesse, da es chemische Reaktionen zur Trennung und Aufreinigung ermöglicht. Bei der Auswahl des richtigen Chromatographie-Harzes für Ihr Verfahren ist es wichtig, dass Sie zunächst die folgenden Punkte berücksichtigen:

• Was sind die bekannten Eigenschaften Ihres Zielmoleküls?
• Was sind die Eigenschaften Ihrer Probe und ihrer Verunreinigungen?
• Welche Verarbeitungsergebnisse möchten Sie erzielen (Aufreinigung oder Analyse)?
• Welche Art von Flüssigkeitschromatographie entspricht den Anforderungen Ihres Experiments?

Die Auswahl der Chromatographie-Harze kann auf der Grundlage Ihrer speziellen Anforderungen an die Verarbeitung verfeinert werden. Je nach Beschaffenheit Ihres Probenmaterials können Sie Harze mit unterschiedlichen Eigenschaften für Nukleinsäuren, Proteine und kleine oder große Moleküle verwenden, um die gewünschten Zielmoleküle aus einem Probengemisch auszuschließen oder einzufangen.

Je nach den physikalischen und chemischen Eigenschaften Ihrer Probe besteht ein ideales Aufreinigungsschema. Mit einem grundlegenden Verständnis der verschiedenen Kategorien von Chromatographie-Harzen und ihrer jeweiligen Techniken lässt sich dies leicht etablieren.

Was sind Chromatographie-Harze?

Das in der Chromatographie verwendete Harz, auch als Medium bezeichnet, ist das Material, das zum Einfangen und Polieren von mAbs, Antikörperfragmenten, Impfstoffen und anderen Biomolekülen bei der Durchführung von Chromatographie-Trennungen verwendet wird.

Bei der Verwendung von Chromatographie-Harz wird das Medium während der stationären Phase in eine Säule gepackt und dort gehalten. Diese Partikel können physikalisch oder chemisch modifiziert werden, um eine spezifische Bindung oder Abstoßung bestimmter Moleküle in einer Probe zu erreichen. Dies kann besonders nützlich sein, da dieses Verfahren eine Zielverbindung selbst aus einem hochkomplexen Gemisch herauslösen kann.

Die Säulen arbeiten in der Regel mit der Schwerkraft, um die gelöste Probe zu bewegen, es kommt jedoch immer häufiger vor, dass die Säulen über mechanische Pumpen mit unterschiedlichem Druck betrieben werden. Forschern stehen verschiedene Medienharze zur Verfügung, um eine Vielzahl von Anforderungen für die Aufreinigung verschiedener Zielmoleküle zu erfüllen.

Bei der Chromatographie gibt es zwei verschiedene Phasen: die stationäre und die mobile Phase. Der Hauptunterschied zwischen den beiden Phasen besteht darin, dass sich die stationäre Phase nicht mit der Probe bewegt, im Gegensatz zur Lösung der mobilen Phase. In der stationären Phase wird häufig ein Harzmedium verwendet, in der mobilen Phase dagegen eine flüssige oder gasförmige Lösung, die bei der Trennung der Probenmaterialien hilft.

Beide Phasen haben unterschiedliche Wechselwirkungen mit der Probe, wobei sich die stationäre Phase in der Regel nicht bewegt, aber dennoch mit der Probe interagiert. Eine Lösung der mobilen Phase kann die Probe auflösen und wandert zusammen mit der Probe durch die stationäre Phase. Diese Lösungen müssen für eine erfolgreiche Trennung kompatibel sein. Weitere Informationen über Techniken und Reagenzien für die Chromatographie finden Sie in den^umfassenden Ressourcen zu Chromatographie-Lösungen von Avantor®.

Hier konzentrieren wir uns auf Chromatographie-Harze, die in der stationären Phase der Chromatographie verwendet werden, sowie auf den Prozess der Auswahl des besten Mediums für Ihre Anwendung.

Aufreinigung vs. analytisches Chromatographie-Harz

Die Flüssigkeitschromatographie kann sowohl im analytischen als auch im präparativen Maßstab durchgeführt werden. Bei einem analytischen Ansatz ist das Ziel oft die Entdeckung, Identifizierung und Quantifizierung eines Zielmoleküls in der Probe. Bei der präparativen Flüssigchromatographie hingegen liegt der Schwerpunkt auf der Isolierung und Aufreinigung von Verbindungen mithilfe einer nachgeschalteten Bioprozesstechnik.

Die Protein-Aufreinigung kann viele Herausforderungen mit sich bringen und erfordert eine Protokolloptimierung für jede Prozessphase. Unabhängig davon, ob es sich bei Ihrem Prozess um eine allgemeinere Auswahl von Molekülen oder um eine hochspezifische Trennung handelt, stehen viele Chromatographie-Methoden zur Auswahl.

Einige Zielmoleküle erfordern möglicherweise einen mehrstufigen Trennungsprozess mit mehrfachem Säulen-Chromatographie-Aufbau, während andere eine Harzlösung mit gemischten Medien benötigen, um spezifischen Forschungsanforderungen gerecht zu werden. Im Idealfall entscheiden Sie sich für eine Methode, die so wenig Schritte wie möglich erfordert, um eine gereinigte Version Ihres Zielmoleküls zu erhalten.

Im Folgenden werden wir einige der gängigsten Formen der Flüssigkeitschromatographie behandeln und dabei die verwendeten Harze und ihre spezifischen Vorteile hervorheben.

Chromatographietechniken basierend auf der Auswahl der Chromatographie-Harze

Die Trennung von Materialien aus einer komplexen Probe kann sich bei der ersten Bewertung Ihrer Methoden als schwierig und mühsam erweisen. Dennoch ist die richtige Aufreinigungstechnik von grundlegender Bedeutung für die weitere Charakterisierung und das Verständnis der Funktion eines Zielmoleküls.

Trotz der hohen Anzahl an Variablen gibt es einige Schlüsselbereiche, auf die Sie sich konzentrieren sollten, wenn Sie die richtige Technik für Ihr Probenmaterial auswählen.

Es ist am besten, mit der primären Aminosäuresequenz Ihres Zielmoleküls zu beginnen. Wenn Sie dies verstehen, erhalten Sie Informationen über das Molekulargewicht, den isoelektrischen Punkt (pl) und die Löslichkeitseigenschaften des Zielmoleküls.

Diese Informationen helfen Ihnen bei der Auswahl des richtigen Chromatographie-Mediums sowie der idealen Wasch- und Elutionspufferbedingungen, die im Aufreinigungsprozess verwendet werden.

Wenn Sie Ihr Zielmolekül noch nicht genau kennen, stehen Ihnen multimodale oder Mix-Mode-Harze für die vorläufige Entdeckung und Aufreinigung zur Verfügung. Andere Methoden wie Hydrophobizitätsdiagramme und Sekundärstrukturvorhersagen können Ihnen bei der Entscheidung für hydrophobe Interaktionschromatographie oder Mixed-Mode-Harze helfen.

Darüber hinaus gibt es Techniken wie Ionenaustausch-, Affinitäts- und Größenausschluss-Chromatographie, die Ihnen die besten Ergebnisse für Ihre Trennungs- und Aufreinigungsprozesse liefern können. Jedes dieser Verfahren kann maßgeschneidert und auf Ihre individuellen Bedürfnisse abgestimmt werden. Um die Vorteile jeder Technik zu verstehen, haben wir im Folgenden die gängigsten Formen der Chromatographie und die jeweiligen Harze, die für die erfolgreiche Durchführung jedes Verfahrens benötigt werden, aufgeführt.

Die vier gängigsten Harze für die Chromatographie

Bei der Wahl des Chromatographie-Harzes, das Ihren Anforderungen am besten entspricht, sollten Sie sich auf vier Kategorien von Harzen konzentrieren. Faktoren wie Reinheit, Oberflächenladung Ihres Zielproteins, Molekülgröße oder sogar die Wechselwirkung zwischen Wasser und Ihrer Probe sind für die Wahl des idealen Harzes entscheidend.

Lassen Sie uns die spezifischen Harztypen auf der Grundlage der verschiedenen Chromatographie-Techniken nun genauer untersuchen.

Affinitäts-Chromatographie (AC)

Diese hochpräzise Form der Chromatographie kann in einem einzigen Schritt eine hohe Reinheit erzielen. Die Affinitäts-Chromatographie (AC) trennt Zielmoleküle durch eine starke, aber reversible Wechselwirkung zwischen dem Probenprotein und einem spezifischen Liganden. Durch diese Bindungswechselwirkung wird der Ligand zusammen mit der Zielverbindung an einem Harz immobilisiert.

Die Bindung und Reinigung mit dieser Technik ist hochselektiv und nutzt die biologische Struktur oder Funktion des Zielproteins aus. Sowohl native als auch rekombinant erzeugte Moleküle können mithilfe der Affinitäts-Chromatographie gereinigt werden, was sie zu einer vielseitigen und präzisen Methode macht.

Einige Anwendungsbeispiele sind Antikörper/Antigen-, Enzym/Substrat- und Enzym/Inhibitor-Wechselwirkungen. Die richtige Auswahl der Liganden für die Affinitäts-Chromatographie ist der Schlüssel für einen erfolgreichen Prozess. Inzwischen sind neuartige Affinitätsliganden auf dem Markt, die weniger kostspielige und chemisch stabilere Strukturen ermöglichen.

Die Affinitäts-Chromatographie bietet eine höhere Selektivität und liefert mit einer solchen spezialisierten Interaktion oft schnellere Ergebnisse. Daher ist die Affinitäts-Chromatographie der häufigste erste (und manchmal auch der einzige) Schritt in einem Workflow-Prozess zur Aufreinigung.

Ionenaustausch-Chromatographie (IEX)

Bei der Ionenaustaus-Chromatographie werden die Moleküle auf der Grundlage ihrer Oberflächenladung getrennt. Diese Wechselwirkung ist reversibel und kann durch den Einsatz eines Chromatographie-Harzes erfolgen, das die entgegengesetzte Ladung der Zielverbindung in Ihrer Probe aufweist.

Ionenaustauscherharze werden durch kovalente Verknüpfung von entweder positiv oder negativ geladenen funktionellen Gruppen mit einer festen Matrix hergestellt. Zu den am häufigsten verwendeten Medien gehören Cellulose, Agarose, Polymethacrylat, Polystyrol und Polyacrylamid.

Eine Proteinprobe wird bei niedriger Ionenstärke in eine IEX-Säule geladen und anschließend mit Puffern mit steigender Ionenstärke gewaschen, um unerwünschte Partikel und Verunreinigungen zu entfernen. Das Zielprotein wird dann entweder durch definierte Salzgradienten oder durch eine pH-Verschiebung eluiert. Bei der Elution durch Salz ist es möglich, dass vor dem Beladen der Säule eine weitere Verarbeitung erforderlich ist, während die Elution durch pH-Wert ohne diesen zusätzlichen Schritt auskommt. Dies liegt daran, dass das Zielprotein durch die pH-Änderung keine Nettoladung mehr trägt und vom Harz gelöst wird (unter Ausnutzung des isoelektrischen Punkts des Zielproteins).

Diese Chromatographie-Technik ist sowohl für das Targeting monoklonaler Antikörper als auch als zweiter Reinigungsschritt nach der Affinitäts-Chromatographie ideal. Darüber hinaus ist das IEX-Harz mit großen Perlen ein hervorragender Ausgangspunkt für die erste Säulenreinigung.

Hydrophobe Interaktions-Chromatographie (HIC)

Diese Technik ermöglicht die Trennung und Aufreinigung von Proteinen und anderen Biomolekülen auf der Grundlage ihrer Oberflächenhydrophobie. Diese Methode ist nützlich für die Trennung und Aufreinigung von Proteinen unter Beibehaltung ihrer biologischen Aktivität. Die HIC verwendet Puffer, Matrizen und Parameter, die weniger denaturierend auf die Probe wirken als andere Methoden. Das macht es ideal für Experimente, bei denen Ihre Proben intakt bleiben und auf andere biologische Eigenschaften überwacht werden müssen.

Salzkonzentrationen, der pH-Wert und die Temperatur können die Bindungsinteraktionen mit den Medien oder sogar die Ligandenchemie, die auf dem Harz immobilisiert ist, beeinflussen.

Die HIC wird in der Regel in Verbindung mit einer vorgeschalteten IEX-Elution mit hohem Salzgehalt und mit nachgeschalteten Größenausschluss-Aufreinigungsverfahren verwendet.

Größenausschluss-Chromatographie (SEC)

Bei dieser etwas anderen Methode wird ein Gelmedium verwendet, um Proteine auf der Grundlage ihrer Größe zu verteilen. Bei dieser Technik binden die Moleküle nicht an das Chromatographie-Harz, sondern werden stattdessen durch die Gelfiltration geleitet.

Das SEC-Gel besteht aus kugelförmigen Perlen, die Poren bestimmter Größe enthalten, um Moleküle entweder in das Medium einzuschließen oder auszuschließen. Die Trennung erfolgt, während die Probe durch die Säule läuft und in der Reihenfolge des abnehmenden Molekulargewichts eluiert wird.

Faction Exchange und Desalt and Buffer Exchange sind die beiden gängigsten SEC-Verfahren. Diese Techniken werden eingesetzt, wenn Methoden wie die IEX oder HIC nicht ausreichen, um die Proteine bis zum erforderlichen Grad der Aufreinigung zu trennen. Die SEC kann oft als letzter Schritt bei der Proteinreinigung eingesetzt werden.

Multimodale oder Mixed-Mode-Chromatographie (MM)

Die Mixed-Mode-Chromatographie wird häufig als Polishing-Schritt bei der Aufreinigung von Biomolekülen eingesetzt. Bei der MM-Chromatographie werden Harze verwendet, die mit Liganden funktionalisiert sind, die zu mehreren Wechselwirkungen fähig sind. Dadurch eignet sich diese Methode für die Aufreinigung von Zielmolekülen ohne bekannte Spezifität.

Diese Technik kann zum Screening, zur Aufreinigung und zur potenziellen Identifizierung von Stellen auf einem Zielprotein verwendet werden, die nützliche Informationen zur Affinität und Selektivität liefern können.

Die einzige Einschränkung dieser Methode besteht darin, dass die Interaktion mit dem Zielmolekül nicht anhand einer einfachen Aminosäuresequenzanalyse vorhergesagt werden kann, da mehrere Bindungs- und Elutionseigenschaften bestehen können. Dies erfordert zusätzliche Schritte im Vorfeld, um die Bindungs- und Elutionsbedingungen zu erproben.

Der Hauptvorteil der MM-Chromatographie besteht darin, dass sie komplementäre Chromatographie-Methoden kombiniert und dabei ein einziges Medium verwendet. Dadurch lassen sich Aufreinigungsschritte einsparen und der Einsatz von wertvollem Probenmaterial kann minimiert werden. In einigen Fällen kann dies auch schnellere Ergebnisse liefern – insbesondere bei Produktverunreinigungen, die dem Zielmolekül ähnlich sind.

Fazit

Chromatographie-Harze sind ein unverzichtbares Werkzeug in der Forschung und Entwicklung. Sie liefern Wissenschaftlern aufgrund ihrer einzigartigen Wechselwirkungen mit einer Probe schnelle und zuverlässige Ergebnisse. Die Auswahl eines kompatiblen Harzmediums ist für eine erfolgreiche Analyse und Aufreinigung unerlässlich.

Die Auswahl des richtigen Chromatographie-Harzes muss trotz der vielen Variablen, die bei der Prüfung der Optionen zu berücksichtigen sind, keine Herausforderung sein. Mit einem grundlegenden Verständnis Ihrer Probe und der Ziele, die Sie erreichen möchten, stehen Ihnen grenzenlose Anpassungsmöglichkeiten zur Verfügung, um Ihre Laborprotokolle zu perfektionieren.

Avantor^® unterstützt Sie bei der Gestaltung eines erfolgreichen Chromatographie-Prozesses – unabhängig davon, ob Ihr Forschungsmaterial bereits gut bekannt ist oder noch erforscht werden muss. Erweitern Sie noch heute Ihre Forschungsmöglichkeiten, indem Sie ein auf Ihre Ziele zugeschnittenes Chromatographieprotokoll erstellen mit Avantor^®.