Zytometrie-Lösungen

Die Durchflusszytometrie ist eine laserbasierte Technologie zum Nachweis und zur Messung der physikalischen und chemischen Eigenschaften von Zellen oder Partikeln, die in einer Flüssigkeitssuspension durch einen beleuchteten Lichtpfad fließen. 

Die Durchflusszytometrie ist eine effiziente Methode, die häufig zur Identifizierung und Charakterisierung verschiedener Immunzellen in heterogenen Proben eingesetzt wird. Sie stützt sich in erster Linie auf die Verwendung fluoreszenzmarkierter Moleküle zur Identifizierung und Charakterisierung von Antigenprofilen in einer Vielzahl von Forschungsanwendungen sowie in der klinischen Diagnostik auf Einzelzellbasis.

Durch die Verwendung verschiedener Fluorochrome mit Emissionswellenlängen, die sich über das gesamte Farbspektrum erstrecken, können Proteine, die mit Oberflächen-, zytosolischen und Kernkompartimenten assoziiert sind, gleichzeitig nachgewiesen werden.

Die Durchflusszytometrie ist eine unglaublich vielseitige Methode und in den letzten Jahren wurden viele Varianten dieser Methode entwickelt. Die fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) ist ein Derivat der Durchflusszytometrie, das über ein höheres Maß an Funktionalität verfügt. In der Praxis werden die Begriffe „Durchflusszytometrie“ und „FACS“ oft synonym verwendet

Die Durchflusszytometrie hat sich als unschätzbares Analyseinstrument im Bereich der Krankheitsdiagnose erwiesen. Eine große Anzahl von Zellen kann in wenigen Minuten analysiert werden, was für die Untersuchung Vorteile gegenüber anderen Analysemethoden wie Cellometer Vision oder Mikroskopie bietet.

Zytometrie-Anwendungen für die Analyse

In einem Durchflusszytometer:

• Die Probenzellen werden nacheinander durch einen schmalen Kanal geleitet.
• Um die Zellen im Kanal zu beleuchten, wird Licht verwendet.
• Eine Reihe von Sensoren erkennt die Lichtarten, die von den Zellen gebrochen oder emittiert werden.
• Die von den Sensoren erfassten Daten werden zusammengestellt und integriert, um ein umfassendes Bild der Probe zu erhalten.

Die Durchflusszytometrie verwendet fluoreszierende Marker zur Identifizierung und Analyse von Zellbestandteilen. DNA, RNA, Proteine oder andere Moleküle in der Zelle werden mit Fluoreszenzfarbstoffen markiert. Wenn die Zelle anschließend mit Laserpulsen „beschossen“ wird, werden die markierten Moleküle für kurze Zeit beleuchtet. 

Das von jeder Zelle emittierte Licht kann dann vom Durchflusszytometer erfasst werden und die relative Menge jeder Komponente kann anhand ihrer Intensität gemessen werden. Dies ist ein entscheidendes Verfahren für die Krankheitsdiagnose und -prognose.

Die Analyse von Durchflusszytometriedaten beruht auf dem Prinzip des Gating. Gates und Regionen werden um Zellpopulationen mit gemeinsamen Merkmalen, in der Regel Vorwärtsstreuung, Seitenstreuung und Markerexpression, platziert, um die Populationen von Interesse zu untersuchen und zu quantifizieren. 

Gating ermöglicht es Forschern, mehr Informationen über eine Unterpopulation von Zellen zu sammeln und anzuzeigen, als dies normalerweise auf einem zwei- oder dreidimensionalen Dot-Plot möglich wäre.

Ein Durchflusszytometer besteht aus drei Hauptsystemen: Fluidik, Optik und Elektronik. 

• Das Fluidiksystem transportiert die Partikel in einem Strom zum Laserstrahl, um sie abzufragen.
• Das Optik-System besteht aus Lasern, um die Partikel im Probenstrom zu beleuchten, und optischen Filtern, um die resultierenden Lichtsignale zu den entsprechenden Detektoren zu leiten.
• Das Elektronik-System wandelt die erkannten Lichtsignale in elektronische Signale um, die vom Computer verarbeitet werden können. Bei einigen Geräten, die mit einer Sortierfunktion ausgestattet sind, kann die Elektronik auch Sortierentscheidungen zum Aufladen und Ablenken von Partikeln einleiten.

Ein Durchflusszytometer wird zur Durchführung der folgenden Aufgaben verwendet, die für die Diagnose von Krankheiten entscheidend sind:

• Blutzellenzahl
• Beobachtung der verschiedenen Arten von Leukozyten in einer Probe
• Sortieren von T-Zellen, um festzustellen, wie ihre Funktion durch eine Infektion beeinträchtigt wurde
• Bestimmung des Gesamt-DNA-Gehalts in Zellen bei der Durchführung von Tumorbiopsien in der Krebsforschung
• Untersuchung der Auswirkungen von Infektionskrankheiten auf einzelne Zellen mit Zellsortierung
• Nachweis pathogener Mikroben in biologischen und Umweltproben
• Nachweis minimaler Krankheitsrückständen in Körperflüssigkeiten

Während die Durchflusszytometrie als zellbiologisches Verfahren gut etabliert ist, hat die Entwicklung der Hochdurchsatz-Durchflusszytometrie (HTFC), die durch die Einführung einer schnelleren plattenbasierten Probenahme ermöglicht wurde, die Technologie auch zu einer attraktiven Plattform für die Arzneimittelentdeckung gemacht.

Einige der wichtigsten Anwendungen für die Durchflusszytometrie (im Rahmen moderner klinischer Einrichtungen) sind: 

• Proteinexpression – in der gesamten Zelle, sogar im Zellkern
• Modifikationen von Proteinen nach der Translation – einschließlich gespaltener und phosphorylierter Proteine
• RNA – einschließlich miRNA- und mRNA-Transkripte
• Zellgesundheitsstatus – Erkennung von apoptotischen Zellen oder Zelltod
• Zellzyklus-Status – ein leistungsstarkes Werkzeug zur Beurteilung von Zellen in der G0/G1-Phase im Vergleich zur S-Phase, G2 oder Polyploidie, einschließlich der Analyse von Zellproliferation und -aktivierung
• Identifizierung und Charakterisierung verschiedener Untergruppen von Zellen innerhalb einer heterogenen Probe – einschließlich der Unterscheidung von zentralen Effektor-Gedächtniszellen von erschöpften T-Zellen oder regulatorischen T-Zellen

Zellauswahl

Im Vergleich zu anderen Isolierungstechniken wie der Magnetkugeltrennung und dem Panning bietet die Durchflusszytometrie folgende Vorteile:

• Höhere Reinheit 
• Zelltypen können anhand ihrer Fluoreszenzintensität unterschieden werden
• Bessere Trennung von Populationen mit mehreren Antikörpern
• Höhere Wiederfindung von Zellen von Interesse
• Möglichkeit zur Beseitigung abgestorbener Zellen
• Möglichkeit zur Sortierung nach interner Färbung (DNA, Zytokinexpression, GFP usw.)
• Möglichkeit zur Sortierung von bis zu vier Populationen gleichzeitig

Zu den Nachteilen bzw. Einschränkungen der Durchflusszytometrie zählen:

• Der Laser kann immer nur eine Zelle auf einmal analysieren 
• Die Zellen müssen sich in einer Suspension befinden, um analysiert zu werden (was die Analyse von Gewebe einschränkt) 
• Es sind umfassend geschulte Bediener erforderlich
• Die Zellen müssen lebensfähig sein, um analysiert zu werden

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